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培養(yǎng)基常見問題

發(fā)布時間: 2024-01-10  點擊次數(shù): 490次

一、如何選用培養(yǎng)基?   選擇培養(yǎng)基沒有一定標準,有幾點建議可供參考:

1. 建立某種細胞株所用的培養(yǎng)基應該是培養(yǎng)這種細胞第一個選的培養(yǎng)基。可以查閱文獻,或在購買細胞株時咨詢。

2. 根據(jù)細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細胞株多選1640;進行細胞雜交、基因轉移實驗,可選擇IMDM。

3. 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞,觀察其生長狀態(tài),可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷,根據(jù)實驗結果選擇最佳培養(yǎng)基,這是最客觀的方法,但比較繁瑣。

4.ATCC(American Type Culture Collection)收集了絕大多數(shù)細胞的詳細資料。打開ATCC網(wǎng)頁的Cells and hybridomas鏈接,輸入細胞名稱就可以搜索ATCC的細胞數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫中有每一種細胞的詳細描述,包括細胞的來源,培養(yǎng)和凍存條件,以及相關文獻等資料。


二、液體培養(yǎng)基可以放-20℃保存嗎?

不可以!因為在-20℃下,培養(yǎng)基中的鹽容易析出,培養(yǎng)基融化后,有的鹽可能無法重新溶解,從而導致培養(yǎng)基滲透壓降低,培養(yǎng)細胞時,細胞容易破裂而死亡。   


三、新配制的液體培養(yǎng)基能保存多久?

我們建議將新配制的培養(yǎng)基放置于4℃,避光保存盡量在一周內使用完畢。培養(yǎng)基越新鮮越好。


四、培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后,可長期保存嗎?

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時,您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。


五、培養(yǎng)基中是否須添加抗生素?

除了特殊篩選系統(tǒng)外,一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。

為防止細菌、真菌污染,可以加入青霉素-鏈霉素雙抗溶液,其培養(yǎng)基中的終濃度為青霉素100U/ml,鏈霉素為100ug/ml。   


六、為何培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中,顏色會偏暗紅色,且pH值越來越偏堿性?

培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中, 培養(yǎng)基內之CO2 會逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結果, 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時, 可以通入無菌過濾之CO2, 以調整pH 值。


七、培養(yǎng)液pH是怎樣影響細胞生長的?

由于大多數(shù)細胞適宜PH值為7.2-7.4,偏離此范圍對細胞將產生有害的影響。各種細胞對PH值要求也不全部相同,原代細胞培養(yǎng)一般對PH值變動耐受差,無限細胞系耐受力強。 但總體來說,細胞耐酸性比耐堿性強一些,偏酸環(huán)境中更有利于細胞的生長。因此,配制培養(yǎng)用液時可把液體的PH值稍微調的偏酸一些。液體在經過0.1um或0.2um濾膜過濾時,PH值會向上浮動0.2左右。


八、為什么液體培養(yǎng)基1640顏色發(fā)黃,是pH值不對嗎?

不是。因為配方原因,1640為堿酚紅型,其中酚紅的濃度只有DMEM的四分之一,所以是因為酚紅濃度低,而非PH值低。


九、為什么有客戶要求培養(yǎng)基中不含酚紅?

研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,細胞培養(yǎng),尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加酚紅的培養(yǎng)基。


十、放置在冰箱中的培養(yǎng)基顏色會發(fā)生變化,為什么?

培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中,培養(yǎng)基內CO2會逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中酸堿指示劑(通常為phenol red)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿后再用于細胞培養(yǎng)將造成細胞生長停滯或死亡。培養(yǎng)基偏堿時,可以通入無菌過濾的CO2,以調整pH值。


十一、無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎?

當在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時,降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。因為血清中的蛋白會結合和滅活一些抗生素。而在無血清培養(yǎng)條件下,抗生素不被滅活。


十二、培養(yǎng)基各個成分的作用有哪些?

1.NaHCO3的作用是什么?

與二氧化碳一起形成緩沖系統(tǒng),保持培養(yǎng)基PH值穩(wěn)定。

2.丙酮酸鈉的作用是什么?

丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源,盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。丙酮酸鈉的貯存液濃度一般為50mM,-20℃保存,培養(yǎng)基中的終濃度為1mM.

3.加入HEPES有何好處?

培養(yǎng)基中經常用的Buffer system是碳酸氫鹽,它可提供營養(yǎng),但卻在生理PH值條件下會降低緩沖能力。而HEPES是一種很強的Buffer,加入HEPES能使細胞培養(yǎng)基在PH7.2-7.6條件下緩沖能力增強。HEPES的貯存液濃度一般為1M,常溫保存。培養(yǎng)基中的終濃度為25mM,即5ml 1M的HEPES加入到200ml全部培養(yǎng)基中。

4.酚紅的作用是什么?

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。

5.谷氨酰胺的作用是什么?

幾乎所有的細胞對谷氨酰胺都有較高的要求。谷氨酰胺脫掉氨基后,可作為培養(yǎng)細胞的能量來源,參與蛋白質的合成和能量代謝。在缺少谷氨酰胺時,細胞生長不良而死亡。所以,各種培養(yǎng)液中都含有較大量的谷氨酰胺。

谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定,應置-20℃冰凍保存,用前加入培養(yǎng)基中。加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基4度冰箱儲存兩周以上時,應重新加入原來量的谷氨酰胺。

試驗操作中常配制高濃度(100倍)的谷氨酰胺溶液(1ml/支),分裝使用,-20℃保存。使用時,每支1ml的谷氨酰胺加入到99ml全部培養(yǎng)基中,使其終濃度為2mM培養(yǎng)基。


 

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