mRNA疫苗在covid-19疫情出圈后,基于mRNA開發(fā)新療法更加受到關(guān)注,包括mRNA傳染病疫苗、腫瘤免疫療法(癌癥疫苗)、治療性蛋白質(zhì)替代療法和遺傳疾病治療等。
基于mRNA技術(shù)的covid-19廣泛使用。目前,全球范圍內(nèi)已有2種mRNA疫苗獲得FDA的EUA(緊急使用授權(quán)),分別是由德國BioNTech、輝瑞和復(fù)星醫(yī)藥共同研發(fā)的BNT162b2(有效率95%)以及美國Moderna公司研發(fā)的mRNA-1273(有效率94.1%)。
在國內(nèi),由沃森生物、蘇州艾博生物、軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院共同研制的mRNA covid-19ARCoV將于5月30日起在墨西哥開始III期試驗(yàn);斯微生物的mRNA疫苗也進(jìn)入了I期臨床試驗(yàn)。
既然mRNA疫苗這么受歡迎,今天我們就來講講mRNA疫苗是如何體外制備的。
mRNA疫苗的制備
以covid-19為例,我們首先分離出病毒株,測序及分析獲得病毒的完整基因序列,然后通過基因工程技術(shù),利用化學(xué)合成的方式,合成S刺突蛋白所對應(yīng)的病毒RNA片段,為了方便接下來的RNA大量復(fù)制,RNA片段首先在DNA聚合酶的作用下,發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。在基因克隆技術(shù)中,通常將要復(fù)制的DNA嵌入到載體質(zhì)粒中,利用細(xì)菌快速繁殖,培養(yǎng),復(fù)制出大量嵌入S蛋白DNA質(zhì)粒的細(xì)菌,經(jīng)過提取,分離,純化等工藝,得到大量純凈S蛋白DNA。S蛋白DNA通過使用轉(zhuǎn)錄試劑完成體外轉(zhuǎn)錄得到大量mRNA,mRNA單獨(dú)存在時(shí)結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定,所以在最終制成疫苗時(shí),需要在mRNA外層包裹一層脂類,最終完成mRNA疫苗的制備。
mRNA的結(jié)構(gòu)及優(yōu)化策略
1 mRNA加帽
真核細(xì)胞mRNA的5'端有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu),它是在mRNA轉(zhuǎn)錄后,由甲基化的鳥苷酸(m7G)經(jīng)焦磷酸化與mRNA的5'端核苷酸相連。5'端帽子結(jié)構(gòu)在mRNA許多生物學(xué)功能中起到重要的作用,這包括:mRNA的剪切、穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)和核糖體的募集等。由于5'端帽子結(jié)構(gòu)的重要生物學(xué)功能,在mRNA疫苗研發(fā)過程中需要優(yōu)化5'端帽子結(jié)構(gòu),并利用合適的工藝對mRNA原料進(jìn)行“加帽”。
mRNA疫苗產(chǎn)品的加帽可以在mRNA的體外轉(zhuǎn)錄過程中通過摻入“帽子序列”實(shí)現(xiàn),這種加帽技術(shù)會(huì)將加帽序列反向加在mRNA上,這會(huì)導(dǎo)致約1/3的加帽失敗。通過摻入特殊的帽子結(jié)構(gòu)——“anti-reverse”帽子結(jié)構(gòu)(ARCA)可以降低這種反向加帽失誤的出現(xiàn)。另外,還可以先合成不帶帽子結(jié)構(gòu)的mRNA,再利用痘病毒的“加帽復(fù)合物”對mRNA進(jìn)行加帽,這也是一種mRNA的加帽手段。
2.非翻譯區(qū)序列(UTRs)修飾
在mRNA的編碼區(qū)兩端各存在一段非翻譯區(qū)(UTRs),在5'端的被稱為5'端UTR,在3'端的被稱為3'端UTR。
非翻譯區(qū)序列不是密碼子,不能翻譯成氨基酸,但是可以通過RNA結(jié)合蛋白控制mRNA產(chǎn)品的降解和轉(zhuǎn)錄效率。因此,每一種mRNA疫苗都需要考慮如何設(shè)計(jì)產(chǎn)品的UTR組件,進(jìn)而提高在目的細(xì)胞中mRNA疫苗的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄效率。大量的研究發(fā)現(xiàn)非洲爪蟾和人源的α-球蛋白/β-球蛋白的UTR序列非常穩(wěn)定,而且能夠增加異源的mRNA的表達(dá)效率,因此這兩個(gè)蛋白的UTR原件通常被設(shè)計(jì)為mRNA疫苗的UTR組件。當(dāng)然,也有其它蛋白的UTRs被研究用于mRNA疫苗的組件,在此不再贅述。
3.Poly(A)
大多數(shù)真核生物的mRNA 的3'端都有由100~200個(gè)腺苷酸聚合形成的Poly(A)尾巴。mRNA的Poly(A)尾巴可以和5'端帽子結(jié)構(gòu)共同合作,增強(qiáng)mRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。Poly(A)尾巴首先和大量的Poly(A)結(jié)合蛋白(PABP)結(jié)合,然后募集真核生物起始因子4G(eIF4G),增加Poly(A)跟5'端帽子結(jié)構(gòu)的親和力,最終mRNA的Poly(A)尾巴和5'端帽子結(jié)構(gòu)首尾相接,形成環(huán)裝mRNA。環(huán)裝mRNA結(jié)構(gòu)有利于核糖體的募集,其特殊的結(jié)構(gòu)也能保護(hù)mRNA不被降解。
在mRNA體外合成過程中,Poly(A)尾巴可以通過質(zhì)粒DNA模板轉(zhuǎn)錄獲得,也可以先合成mRNA再通過Poly(A)聚合酶加上不同單位數(shù)量的尾巴。前者能夠在mRNA產(chǎn)品中加入特定數(shù)目的Poly(A),而后者加入的單位數(shù)不確定。
Poly(A)尾巴的單位數(shù)目對于其生物學(xué)作用起到了至關(guān)重要的作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),活躍表達(dá)的mRNA包含的Poly(A)序列的長度為100-250個(gè)。有研究發(fā)現(xiàn),表達(dá)效率越高的mRNA,其Poly(A)尾巴越短。但是當(dāng)Poly(A)單位長度小于12時(shí),mRNA結(jié)構(gòu)就不再穩(wěn)定,容易被降解。在設(shè)計(jì)mRNA疫苗產(chǎn)品的序列時(shí),Poly(A)的長度也是非常重要的優(yōu)化指標(biāo)。
4. 開放閱讀框
開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)包涵了mRNA的全部編碼序列,負(fù)責(zé)進(jìn)入人體后表達(dá)mRNA運(yùn)載的抗原靶蛋白。
密碼子水平的修飾,利用常用的密碼子,選用tRNA較多的密碼子;使各個(gè)密碼子的比例更接近靶物種或者細(xì)胞的比例;
GC含量的修飾,避免復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)形成;二級結(jié)構(gòu)對mRNA的延伸和轉(zhuǎn)錄非常重要,高穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)需要避免。這樣的二級結(jié)構(gòu)可以阻止核糖體的進(jìn)入、掃描以及容易被先天性免疫識(shí)別為PAMP。
mRNA疫苗制備試劑盒:
Cellscript T7 mScript™ Standard mRNA Production System C-MSC11610/C-MSC100625
該試劑盒包含T7 RNA聚合酶,加帽酶,加尾酶,以及2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶, 可以一站式解決mRNA制備過程。
T7-FlashScribe™ Transcription Kit C-ASF3507 以1ug線性化的DNA為模板,在30min內(nèi)體外轉(zhuǎn)錄可以得到180ug的RNA。
其他相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 品牌 |
T7-FlashScribe™ Transcription Kit | C-ASF3507 | cellscript |
T7-Scribe™ Standard RNA IVT Kit |
| cellscript |
ScriptCap™ m7G Capping System | C-SCCE0625 | cellscript |
ScriptCap™ 2'-O-Methyltransferase Kit | C-SCMT0625 | cellscript |
ScriptCap™ Cap 1 Capping System | C-SCCS1710 | cellscript |
A-Plus™ Poly(A) Polymerase Tailing Kit | C-PAP5104H | cellscript |
北京和一生物作為Cellscript的國內(nèi)授權(quán)代理,為你提供CellScript公司全套的mRNA生產(chǎn)的原料,目前產(chǎn)品主要包括體外轉(zhuǎn)錄試劑盒,帽類似物,加帽酶,加尾酶,以及一些修飾核苷等等,北京和一生物為你提供全套mRNA制備的解決方案,助力抗擊covid-19,期待你的咨詢!